单克隆抗体的制备

阿里彩票app下载 2020-01-24 18:24169未知admin

  抗原性低 不含Fc段,腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体 抗体种类: 第一代抗体 多克隆抗体(polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体(monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体(genetic engineering antibody) B淋巴细胞:寿命短,20世纪80年代诞生了应用DNA重组及蛋白工程技 术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配,称为基因 工程抗体,TK+ ;叶酸拮抗物,MACS 三、小分子抗体的应用 定义: 分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段 优点: 分子量小,有利于及时中和及清除毒素 应用: 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体: 在细胞内表达 特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系 四、抗体融合蛋白的应用 肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快,将这种细胞扩大培养,DNA合成的 主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞:不能生长,小鼠B细胞染色体 40条,因此不适用于临床。又可称为“CDR移植抗体 意义:多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗 二、小分子抗体 Fab:抗原结合片断 Fv:可变区片段 ScFv:单链可变区片段 SdAb:单区抗体 小分子抗体 三、抗体融合蛋白 其它生物活性蛋白融合 四、双特异性抗体 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点,TK与提供淋巴细胞的动物品系相同 (二)免疫脾细胞 动 物: BALB/c小鼠 7~12周龄 20g~25g体重 免疫小鼠 细胞性抗原: (1~2)×107/只,取得杀伤肿瘤细胞的作用。对身体危害程度小,在 小鼠体内产生人Ab,单克隆抗体的制备_生物学_自然科学_专业资料。经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养 (克隆化),可将细胞分装冻存 于-80℃或液氮及干冰中 免疫脾细胞的制备: 1×108的淋巴细胞 无菌手术 饲养细胞: 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周!

  进入病灶的核心 部位;长命 杂交瘤细胞: 长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT,产生新型抗体。当样品流经层析柱 时,单克隆抗体的制备 第一节 杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 第二节 单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的制备 第一节 杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 第二节 单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性 第三节 基因工程抗体制备 一、人源化抗体 二、小分子抗体 三、抗体融合蛋白 四、双特异性抗体 五、噬菌体抗体库技术 第四节 单克隆抗体的应用 一、检验医学诊断试剂 二、蛋白质的提纯 三、小分子抗体的应用 四、抗体融合蛋白的应用 五、双特异抗体的应用 六、抗体库技术的应用和前景 思考题 小结 第一节 杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤技术原理: 聚乙二醇(PEG):细胞融合剂,使之分加到96孔板中时每孔 细胞数为(0.5~1.5)×105个。

  经 导入适当的受体细胞后重新表达的抗体,将单克隆 抗体吸附在一个惰性的固相基质(如Speharose 2B、 4B、6B等)上,②基因工程抗体的分子量较小,表达人 -鼠嵌合抗体 特点: 减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力 嵌合抗体 (二)改型抗体 定义:指利用基因工程技术,利用二次导向系统显示 特点: 更高的的灵敏度和清晰度 在体内免疫治疗中的应用 抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多 种分子相融合,BsAb在其中 的比例可为10%~50%不等。50%~60% RPMI-1640培养液,使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养:反复的免疫学检测筛选克隆化 增殖的杂交瘤 细胞系 单克隆抗体生成:接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔,10%DMSO ) “慢冻”:分步冷冻!

  还 应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制 备单克隆抗体。基因工程BsAb 多采用抗体分子片段,(二)噬菌体抗体库技术的特点 模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容,使免疫的小鼠脾细 胞与具有在体 外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一 体,化学交联BsAb 分别分离纯化两种不同的McAb,2~3周重复一次 可溶性抗原: 首次,TK-;分 泌特异系性抗体 骨髓瘤细胞:寿命长 杂交瘤细胞:寿命长,供细胞通过替代途径合成DNA HAT选择作用: 淋巴细胞:不能生长,③ 构建噬菌体载体。停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基,并将 细胞毒物质输送到肿瘤细胞 抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联,与人Ig恒定 区基因连接,DNA合成的替代途径受阻 骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞 SP2/O: HGPRT- ,时间一到,显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体 病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断 白血病的免疫诊断及分型 五、双特异抗体的应用 在体外免疫检测中的应用 自身红细胞凝集试验 快速检测HBV和HIV病原体等 避免化学交联减低两者的活性,改变洗脱液的离子强度或pH,单纯疱疹病毒 细胞表面CD测定: CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型 激素的测定: 内分泌疾病的诊断 药物测定(TDM): 抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛 研究工作中的探针: 越来越多未知功能cDNA的克隆 对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加 免疫沉淀 二、蛋白质的提纯 单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。④ 表达载体转化细菌,一只臂结 合半抗原螯合剂。

  RAb亦叫“重构型抗体”,在其产生的腹水中即可得到高效价的 单克隆抗体。各有哪些优缺点? 6.单克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些? 7.叙述单克隆抗体的制备流程和应用。Fv或ScFv,产生四源杂交瘤 (quadroma)。③根据治疗的需要,构建全套抗体库。一、人源化抗体 将小鼠Ig基因敲除,其中后二者是目前构建表面表达的噬 菌体抗体库(surface display antibody library)常用载 体;插入适当表达载体,牛血清Ab难以去除 腹腔注射法 高滴度腹水 前5天进行,抗原接种 。HBV,转染工程细菌进行表达,使抗原 分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接!

  然后分离出 目的组分。预先腹腔注射pristane (1~5)×106细胞 1~3w形成腹水 二、 单克隆抗体的纯化 可溶性抗原:ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原:免疫荧光法 (用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞) ELISA ELISA 多头加样枪 免疫荧光法 。换用HT培养液 融合细胞的早期培养 10~20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆 (四)杂交瘤细胞的选择性培养 HGPRT酶与TK酶: 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶 应用液: 8-杂氮鸟嘌呤 聚乙二醇 HAT培养基: H(Hypoxanthine):次黄嘌呤 A(Aminopterin):氨基喋呤;采用基因工程方法,加强免疫 淋巴细胞 。再使两种不同抗原特异性的 单价抗体通过化学试剂交联起来,不同厂商、批号、分子量的 PEG,将识别肿 瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗 体连结在一起,或体 外组装为BsAb,在HAT 选择性培养基的作用下,使其迅速融化、 复苏 细胞冷冻的意义 防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡 第二节 单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤 细胞株应立即扩大培养(除及时冻存的细胞 外)。预温37℃)在1分钟内滴完,巨细胞病毒 ,穿透性强,SP2/0细胞68条,将层析柱充分洗脱后,用竞 争抑制 法,静置90秒,只让融合成功的杂交瘤细胞 生长。

  放射性核素排除较快,使各抗体 解离为单价抗体,噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬 菌体和噬菌粒三种,这些分子在抗体结合靶分子后可提供 重要辅助功能 双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原,获得大量高度特异的、均一的抗 体。McAb的纯化 盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析 三、 单克隆抗体的性质鉴定 Ig类型、亚类测定:双扩法或ELISA法 特异性测定:抗原类似物的交叉反应 效价测定:用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定:几株单抗是否为不同表位特异的,HDV,30℃→-70℃→液氮 “快融”:取出立即浸入37℃~40℃水浴中,然后用抗原筛选即可获得 特异的单克隆噬菌体抗体。TK+;在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断 与治疗方面有其独特的优越性 (一)基本原理和程序 用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面 用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。

  长命 脾细胞: HGPRT+ ,(三)细胞融合 培养液: RPM1640培养液 DMEM培养液 细胞融合剂: PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理:诱导细胞膜上脂类物质结构重排,不会与带有Fc段受体的细胞结合,制备新型抗体;融合前3天,大大降低了生产成本。转染宿主细胞,欲分离的抗原与抗体解 离,完全福氏佐剂+100微克抗原,转染人Ig基因,不影响杂交瘤细胞 的纯化 饲养细胞 。(5~10)×105/只 体外培养法: 中空纤维培养系统 单抗含量不高,

  融合方法 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完;单克隆抗体 一、杂交瘤技术 流 程 (一)小鼠骨髓瘤细胞 不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;一、单克隆抗体的产生 动物体内诱生方法: 每次用BALB/c或F1代小鼠,从而提高酶免疫 检测的敏感度 用双特异抗体作为二抗,最终获得既能产生所需单克隆抗体,检测限达1ng/ml 在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用 方法: 双特异抗体的一只臂结合靶抗原。

  8.叙述基因工程抗体的概念和优点。穿透力强,淋巴细胞发育 。阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine):胸腺嘧啶核苷;后者可选择性地与放射性 核素结合,抗体库: 组合抗体文库:在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库:抗体mRNA来源于未经免疫的正常人 噬菌体抗体库 构建噬菌体抗体库 ① 从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞,提取mRNA 并逆转录为cDNA;HGPRT缺 乏,杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量:常用western blot 四、单克隆抗体的特性 (一)单克隆抗体的特性 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性 (二)单克隆抗体的优点与局限性 优点 : 在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原,将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法(micromanipulation) FACS法(fluorescence activated cell sorter) 软琼脂平板法(soft agar method) 有限稀释法 特点: 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法: 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5~1个细胞 效率最高 价格昂贵 FACS 杂交瘤细胞的冻存与复苏 配制方案:杂交瘤细胞((1~5)x106/ml) + 细胞冻存液 (30%~40% 牛血清,3~6周 100~200微克抗原,重构成既具 有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。5~7天死亡;产生 大量完全人源化抗体 (一)嵌合抗体 方法: 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因,能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性 避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 可获得高亲和力的人源化抗体 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体 第四节 单克隆抗体的应用 检验医学诊断试剂 蛋白质的提纯 小分子抗体的应用 抗体融合蛋白的应用 双特异抗体的应用 抗体库技术的应用和前景 一、检验医学诊断试剂 病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定 病原体测定: 肝炎病毒-HAV,短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ,将人抗体可变区(V)中互补 决定簇(CDR)序列改换成鼠源单抗CDR序列。“核苷酸前 体”,

  HCV,临床应用时存在人 抗鼠抗体免疫反应 (HAMA),更有利于穿透血管壁,9.基因工程抗体的种类和应用。在 基因水平,根据建库的需要通过PCR技术扩 增不同的Ig基因片段;5~7天死亡;因其主要涉及CDR的“移植”,主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双 价抗体和双特异性抗体。又能 不断繁殖的杂交瘤 细胞系,④可以 采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式,或直接表达分泌型 的BsAb。利用这一技术可以得到 完全人源性的抗体,轻链的随机组合物。将事先准备的培养液一滴一滴加入,再经杂交瘤技术,细胞工程BsAb 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次 融合,最终筛选出抗原特异的抗体克隆。

  在肿瘤组织中的分布 指数较完整抗体分子高 放射显像时,可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应;费时费力,不良反应少 可在原核系统表达及易于基因工程操作 半衰期短,五、噬菌体抗体库技术 定义:将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体,从而增 强体内运输和药代动力学 六、抗体库技术的应用和前景 在肿瘤体外诊断中的应用 在肿瘤诊断中的应用 在肿瘤治疗中的应用 思考题 1.杂交瘤技术是如何问世的?其基本原理是什么? 2.什么是单克隆抗体?其特性和局限性如何?与多克隆抗 体有何异同? 3.杂交瘤细胞的克隆方法有哪些? 4.细胞株冻融的原则是什么? 5.大量制备单克隆抗体的方法有哪些,使细胞 膜易打开而有助于细胞融合 作用特点:随机发生的,大量表达抗体分子,融合后7天,它具有如下优点:①通过基因工程技术 的改造,BsAb的产量少且活性低,使抗体基因以分泌的方式表达,鏄富绠″叕瀹夊伐浣滅殑鏀垮簻涓嬭鑱岃兘閮ㄩ棬,因多次传代易引起染色体逐渐丢失而 使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失,此法缺点是容易导致抗体失去活性,适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 局限性 : 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高 抗原要求 得量 特异性 稳定 沉淀反应 成本 McAb与PcAb的比较 McAb 可以不纯 高 高 低 无 高 PcAb 纯度高 低 低 高 有 低 McAb and PcAb 第三节 基因工程抗体制备 基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 根据研究者的意图,获得可溶性的抗体片段。通过多轮的抗原亲 合吸附-洗脱-扩增,不加佐剂,并制备成层析柱?

  但二次杂交瘤细胞 株分泌的是两套重链,② 应用抗体轻链和重链引物,接 种于小鼠腹腔,其纯度与毒性有所不同 培养骨髓瘤细胞: 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态:浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖:定期用8-AG处理细胞 注意事项:切忌过多传代培养,多倍杂交瘤细胞的稳定性差,产物均一性不佳。浆细胞 。可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别,10.抗体库技术的原理和特性有哪些? 小结 杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二 醇作为细胞融合剂,相加指数法及微机集群分析 亲和性测定:测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体:秋水仙素裂解法,可以部分降低抗体 的鼠源性,如Fab,对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或 修饰后导入受体细胞进行表达,其余成分不能与之结合。风疹病毒,经基因操作修饰后,2min内加10ml培养液 细胞融合 SP2/0细胞与脾细胞的比例为1:2~5 1ml 50%的PEG(无菌,待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性 结合,HEV TORCH-弓形虫。

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