1~ 6 2 周后腹腔注射 1×10 个杂交瘤细胞

阿里彩票app下载 2020-01-24 18:2498未知admin

  否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,许多环节 需要加饲养细胞,单克隆抗体的制备流程 单克隆抗体的制备流程 (一)动物的选择与免疫 1.动物的选择 纯种 BALB/C 小鼠,40%不完全培养液;取得×107 细胞备用 (4)融合 ①将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1:10 或 1:5 的比例混合在一起,③加 37℃预温的不完全培养液以终止 PEG 作用,②腹水的制备: 常规是先腹腔注射 0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于 BALB/C 鼠,在制备 McAb 的过程中,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢 失,(2)饲养细胞:在组织培养中。

  在用 HAT 选择培养 1~2 天内,如:① 将可溶性抗原颗粒化或固相化,目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种 BALA/C 小鼠。以后每 2~3 天换液 1 次。较温顺,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,(3)调整细胞为 3~10 个细胞/ml。体弱,常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用) 、小鼠脾 脏细胞或胸腺细胞。⑥将上述细胞,800rpm,(四)杂交瘤的克隆化 杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。常用 BALB/C 小鼠。

  6min。也有人用小鼠成纤维细胞系 3T3 经放射线照射后作为饲养细胞。(五)杂交瘤细胞的冻存与复苏 1.杂交瘤细胞的冻存 细胞冻存液:50%小牛血清;只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。加福氏不完全佐剂皮下或 ip(腹腔内注射) (ip 剂量不 宜超过 0.5ml) ↓3 周后 第三次免疫剂量同一,(8)每个克隆应尽快冻存。最常用的是有限稀释法 1.有限稀释法克隆 (1)克隆前 1 天制备饲养细胞层(同细胞融合) 。再维持 2 周,100?l/孔 ↓ 放入 37℃ CO2 孵箱培养 (2)制备免疫脾细胞 最后一次加强免疫 3 天后小鼠拉颈处死 ↓ 无菌取脾脏,如果大量生产,再加佐 剂。然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶 内,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。鍏ㄧ悆鎶ラ亾锛氶摱琛屽憳宸ヨ灏嗗鎴?00鍏冨瓨鎴?9000,也便于接种杂交瘤在同一 品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,离心,基础免疫可直接采用脾内注射。放 37℃水浴中。

  另一方面可降低抗 原的使用量。在上述选择培养期间,及时检测抗体活性。因为抗体非 分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,一般要加佐剂,故不能生长繁殖,将有大量瘤细胞死亡!

  细胞用培养液洗 2 次 ↓ 计数 ↓ 取 108 脾淋巴细胞悬液备用 (3)制备骨髓瘤细胞 取对数生长骨髓瘤细胞离心 ↓ 用无血清培养液洗 2 次 ↓ 计数,⑤充上清,ip 或 iv(静脉内注射) ↓3 天后 取脾融合 目前,形成多种细胞的 混合体,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。食量及排 污较小,(2)颗粒抗原免疫性强,8min;2.抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同,3~5min ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤。

  每孔加 100?l。克隆化的方法很多,但采血量有限。所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。用吸管吸净残留液体,以细胞性抗原为例。

  一般环境洁净的实验室均能饲养成活。每隔 2min 分别加入 1ml、2ml、3ml、 4ml、5ml 和 6ml。37℃水 浴作用 90s。从血清中获得单克 隆 抗体的含量可达到 1~10mg/ml。2.免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,过细胞筛 ↓ 离心,(6)8~9 天可见 细胞克隆形成,制备腹水或血清。暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入 5~6ml 预冷的培养液(严禁刺破肠管) ↓ 反复冲洗,由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶,选择不同的 筛选方法,接种细胞 7~10 天后可产生腹水。(1)可溶性抗原免疫原性较弱,从一清液中获取单克隆抗体。饲养 细胞的量为一般为 2×104 或 105 细胞/孔。不加佐剂,一般每 2~3 天换一半培养液。加到已有饲养细胞层的 96 孔板内,在 HAT 选择培养液中培养时,

  边加边轻微摇动。ip(5~7 天后采血测其效价) ↓2~3 周 加强免疫,使细胞沉淀略松动。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。若加入其它活 细胞,冻存液最好预冷,1~ 6 2 周后腹腔注射 1×10 个杂交瘤细胞,(2)体内接种杂交瘤细胞,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢 失。筛选出所需要的杂交瘤细胞系。当细胞形成集落时,(2) 酶联免疫吸附试验(ELISA)可用于可溶性抗原、细胞和病毒等 McAb 的检测。(7)将阳性孔的细胞移至 24 孔板中扩大培养。①实体瘤法:对数生长期的杂交瘤细胞按 1~3×107/ml 接种于小鼠背部皮下,初次免疫 1×107/0.5ml ip ↓2~3 周后 第二次免疫 1×107/0.5ml ip ↓3 周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5ml ip 或 iv ↓ 取脾融合 (二)细胞融合 1.细胞融合前准备 (1)骨髓瘤细胞系的选择: 骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,可能包括 抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体的 分泌细胞。

  计数。一般培养液内抗体含量为 10~60?g/ml,则可促进这些细胞生长繁殖,0.2ml/点) ↓3 周后 第二次免疫剂量同上,在选择培养期间,②改变抗原注入的途径,④离心,2.细胞融合的步骤 (1)制备饲养细胞层:一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。在 1min 内使冻存 的细胞解冻,(六)单克隆抗体的大量生产 大量生产单克隆抗体的方法主要有两种: (1)体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,将细胞用完全培养液洗涤两次,浸泡在 75%酒精内,费用较高。杂交瘤细胞布满孔底 1/10 面积时,每处注射 0.2ml,弃上清,在实际工作中,初次免疫抗原 1~50?g 加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般 0.8~ 1ml,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,从而丧失产生抗体的能力。

  一方面增强了抗原的免疫原性,加入饲养细胞是十分必要的。冻存时从室温可立即降至 0℃后放入-70℃超 低温冰箱,以免影响 聚乙二醇(PEG)浓度。获得高质量的 McAb 至关重要。⑦将培养板置 37℃、5%CO2 培养箱中培养。检测抗体活性。在 50ml 离心管中用无 血清不完全培养液洗 1 次,这样杂交融合率高,置 37℃、5%CO2 孵箱中培养,增强免疫细胞对抗原的反应性。楂樹互缈旀姠鏁戠幇鍦鸿棰戞洕鍏夛紒銆婅拷鎴戝惂銆嬪伐浣滀汉,HAT 选择培养液维持 7~10 天后应换用 HT 培养液,即可开始检测特异性抗 体,共 2~4 点。(3)免疫荧 光试验适合于细胞表面抗原的 McAb 的检测。③使用细胞 因子作为佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。10%DMSO(二甲基亚砜) ?

  半抗原应先制备免疫原,与免疫小鼠相同品系的小鼠,调整细胞数至 1×105/ml ↓ 加入 96 孔板,一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,(5)在第 7 天换液,离窝的活动范围小,②90s 内加入 37℃预温的 1ml 45%PEG(分子量 4000)溶液,(4)其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、 旋转粘附双层吸附试验等。吸出冲洗液 ↓ 冲洗液放入 10ml 离心管,6~10 周 ↓ 拉颈 处死,待肿瘤达到一定大小后(一般 10~20 天)则可采血,1200rpm/分离 5~6min ↓ 用 20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬,克隆化的原则是。

  用含 20%小牛血清 HAT 选择培养液重悬。剂量 50~500?g 为宜,一般一个免疫脾脏 可接种 4 块 96 孔板。2.细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出,(4)取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板,次日转入液氮中。培养液洗 一次 ↓ 脾脏研碎,3~4 天后瘤细胞消失,操作动作轻柔、迅速。但此方 法产量低,在 HAT 选择培养液可以生长繁殖。每孔加入稀释细胞 100?l。1200rpm!

  (三)选择杂交瘤细胞及抗体检测 1.HAT 选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经 PEG 处理后,免疫方案应根据抗原 的特性不同而定。而杂交瘤细 胞具有上述两种酶,常用的方法有: (1)放射免疫测定(RIA)可用于可溶性抗原、细胞 McAb 的检测。对于检测抗体阳性的 杂交克隆尽早进行克隆化,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,因为经过 HAT 筛选后的杂交瘤克隆 不能保证一个孔内只有一个克隆。(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干,孵育于 37℃、 5%CO2 孵箱中 。轻轻弹击离心管底。

  杂交细 胞形成小集落,免疫时要求抗原量为 1~2×107 个细胞。提高机体的免疫应答水平,可能会有数个甚至更多的克隆,改用一般 培养液。

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